Diagnóza botulizmu je založená na identifikácii Clostridium botulotoxínu v laboratóriu a na pozorovaní klinických príznakov, aj keď sú niekedy nešpecifické. Choroba môže byť v skutočnosti zamenená so syndrómom Guillain-Barré, poliomyelitídou, mozgovou príhodou, myasthenia gravis a paralýzou kliešťov.
V potravinovom botulizme sú dôležitými vodidlami obraz neuromuskulárnych porúch a požitie potenciálne kontaminovaných potravín. Simultánna manifestácia u najmenej 2 pacientov, ktorí jedli rovnaké jedlo, zjednodušuje diagnózu. Potvrdenie sa získa izoláciou mikroorganizmu kultivačným testom suspektných vzoriek potravín alebo výkalov pacienta a identifikáciou botulotoxínu v potravinách alebo biologických materiáloch (ako je krv, žalúdočná šťava a zvracanie).
Na druhej strane v botulizme rany to potvrdzuje diagnóza sérového toxínu alebo izolácia Clostridium botulinum zo vzorky kožných lézií.
